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上一节我们聊到其他各种模型方案各自的缺陷，包括难以形成特定的生理结构、无法发挥相对应的功能、形成的信号通路与人体不一致等。因此类器官培养体系的一大重点便是了解目标器官在体内的结构，尽可能完整的还原其在身体中的生长环境以及信号通路。
本篇将以肠道类器官为例，为大家简要介绍肠道的结构与功能。
肠道在功能和解剖学上分为小肠和大肠。小肠由十二指肠、空肠和回肠组成，而大肠由盲肠（包括阑尾）和结肠组成，结肠可进一步分为升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠。
图（A）（B）（C）小鼠肠道准备流程
肠道最主要的作用是从摄入的食物中吸收营养，其吸收功能主要由肠上皮吸收细胞膜刷状缘中的特定营养转运体介导（Daniel and Zietek，2015)，其中一些转运体还可运输药物（Daniel and Kottra，2004)，功能上，食物消化后营养和矿物质的摄取发生在小肠。因此，大多数营养转运体在十二指肠及空肠中表达（Wuensch et al.2013; Yoshikawa et al.2011)。肠道相关淋巴组织（gut associated lymphoid tissueGALT）在回肠聚集形成所谓派尔集合淋巴结（Peryers patches)，体现了肠道作为免疫器官的重要作用，而大肠主要负责液体的吸收，且容纳了绝大多数的肠道微生物。
几乎整个胃肠道均起源于内胚层。在胚胎发育期间，十二指肠的近端部分（直至胆管入口）由前肠形成，消化道的大部分（从胆管到横结肠的近端）由中肠形成，横结肠远端1/3、降结肠、乙状结肠及直肠由后肠形成，位于胃肠道黏膜层的肠神经系统（enteric nervous system，ENS）调控肠道功能。
胃肠壁本身由4层组成：黏膜层、黏膜下层、肌层及浆膜层（也称外膜）。最外层也就是浆膜层或外膜，由结缔组织组成，包裹肌层及肌间神经丛；黏膜下层由包含有大血管、神经管及神经的结缔组织组成，将黏膜连接至肌层，并支持其功能。黏膜层是胃肠道的最内层，可进一步被细分为黏膜肌层（一层薄薄的平滑肌）、固有层（一层包含免疫细胞的结缔组织）和上皮层（覆盖肠道单层上皮细胞，形成宿主及管腔之间的屏障），多数消化、吸收及分泌过程均通过肠上皮细胞进行。
1）干细胞负责每4—5天不断更新上皮细胞；
2）潘氏细胞为位于隐窝底部的干细胞龛提供因子，同时分泌抗菌肽；
3）分泌黏蛋白的杯状细胞可形成覆盖上皮的黏液，构建物理屏障；
4）肠上皮吸收细胞可吸收营养和离子；
5）EECs可分泌多种激素，控制肠道运动并调节代谢；
6）含有味觉化学感受器的tuft细胞可参与免疫调节（Barker，2014)。
需要注意的是，小肠上皮均有隐窝及绒毛，绒毛的长度从十二指肠到回肠逐渐增加；而结肠上皮仅有隐窝，没有绒毛。
小肠上皮细胞构成示意图
在正常生理条件下，结肠远端不存在潘氏细胞，刚才有提到潘氏细胞为位于隐窝底部的干细胞龛提供因子，同时分泌抗菌肽，这表明小肠和结肠的干细胞稳态存在差异。这是小肠类器官培养过程中不需要添加Wnt蛋白，但结肠类器官培养基需要添加Wnt蛋白的核心原因。
①建立器官发育与形态发生模型；
②建立疾病模型；
③再生医学/精准医学研究。
单个干细胞或分离的肠道隐窝均可培养形成肠道类器官（Sato et al., 2009)。
类器官的体外3D培养需要适当的细胞外支架来支持细胞黏附并作为膜蛋白的配体来触发调节细胞过程的信号，包括存活、迁移、增殖、活性维持和分化成特定谱系。支架是工程化的聚合生物材料，其支持类似于体内微环境的细胞组织，促进细胞重组为功能性组织，在此期间细胞分泌细胞外基质和酶，允许细胞通过周围材料扩散和迁移。
分布在各类细胞周围的基底膜
3D类器官培养主要使用一种胶状基质（商业上称为基质胶），该基质是从Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤小鼠肿瘤衍生的细胞系中分离出来的基质基础上开发得到的胶状基质（Liet al.1987)。
目前在全球广泛使用的品牌是美国康宁公司的Matrigel，由于其垄断地位及需求的暴增导致产品产能不足，近年中国厦门模基生物也推出同款产品：Matrigengel，在类器官培养中也被国内外科学家广泛使用。
模基生物基质胶
这种胶状基质在1987年第一次被开发出来。1991年第一次被Aggeler用于乳腺上皮细胞的三维培养，其结构类似于乳腺组织中的腺泡结构（Aggeler et al., 1991)。基于此，基质胶从此成为培养乳腺上皮细胞标准方法中的重要成分。
2009年Hans团队首先利用基质胶构建了第一个类器官：上皮类器官，从此天然基质胶被广泛用于类器官培养。
为了成功建立类器官，必须仔细考虑不同的可用方案，除了所需的生物材料基质外，还需要考虑添加细胞培养、增殖及分化所必需的生长因子，从而保证类器官中的干细胞长期生存的能力。这些生长因子模拟生理组织自我更新或损伤修复过程中的干细胞巢环境，可以通过优化培养物生长条件来实现，如提供基底膜基质（即Matrigengel）并添加一系列激动剂（如Wnt和酪氨酸激酶受体）和抑制剂（如骨形态发生蛋白/转化生长因子－β）。这些生长因子会因所用类器官干细胞的性质而有所差异，研究人员仍在不断改进生长因子的添加配方，以进一步提高类器官体外存活率。
在类器官中加入必要的生长因子，有助于干细胞在体外更好地增殖分化，从而形成类器官。例如，2009年Hans Clevers实验室将来自小鼠肠道的肠道成体干细胞接种于基质胶中，并在培养基中添加R-spondin、Noggin、表皮生长因子等干细胞必要生长因子，才培养出了第一个具有隐窝样结构的小肠类器官。目前主要在类器官培养中使用的生长因子包括：可支持干细胞增殖分化的生长因子如Wnt-3A、R-spondin-1、Noggin等及小分子抑制剂等。
Wnt-3A是Wnt/β-catenin信号通路的激活因子，可以促进干细胞增殖分化，也在肿瘤发生中发挥重要作用。目前，Wnt-3A已被报道用于脑类器官及肝脏类器官培养基，除了Wnt-3A外，R-spondin-1是Lgr5的配体，而Lgr5阳性的干细胞已被证实具有扩增成为类器官的潜能。同时，R-spondin-1作为Wnt信号通路的激动剂，可以通过增强Wnt信号在多方面发挥作用。因此，在乳腺类器官、小肠类器官、肝脏类器官等多个类器官的培养过程中均发挥重要作用，是类器官培养中最常见的生长因子之一。
Wnt/β-catenin信号通路
骨形态发生蛋白4(BMP4）是TGF－β超家族的一员，在细胞增殖分化中发挥重要作用可以抑制Wnt信号，从而控制干细胞的自我更新。BMP4被广泛用于肠道类器官的研究，调节肠道内分泌细胞的激素水平。Noggin也是TGF-β超家族的一员，可以与 BMP4、BMP7结合，是骨形态发生蛋白抑制剂的分泌蛋白，与骨形态发生蛋白起到相反的作用。Noggin与骨形态发生蛋白结合可以协调 Wnt信号激活干细胞，促进其增殖。因此，Noggin已经被广泛应用于各种类器官的长期培养，如肝脏类器官、小肠类器官及输卵管类器官。
表皮生长因子（epidermalgrowth factor，EGF）主要促进细胞的增殖，已被报道在输卵管类器官及小肠类器官中发挥促进类器官生长发育的重要作用。成纤维细胞生长因子（FGF）可抑制骨形态发生蛋白，从而促进类器官生长。目前，FGF2、FGF7和FGF10是常用于类器官研究的家族成员，对类器官中多种干细胞的增殖分化具有重要的调控作用。血管内皮生长因子（VEGF）不仅在类器官的血管生成及内皮细胞生长中发挥重要作用，还可以促进肾脏类器官的干细胞增殖，增强心脏类器官的心脏功能，促进脑类器官的神经分化等，因此被广泛用于促进类器官扩增与微环境调控。肝细胞生长因子不仅可以促进肝脏类器官的形成，还可以维持胃类器官和小肠类器官的生长。
VEGF信号通路
除了上述生长因子，还有各种小分子抑制剂被添加至类器官培养基中，如CHIR99021、Y-27632、A83-01和SB431542，它们通过特异性地阻断或激活各种信号通路，对干细胞的自我更新和增殖起到重要作用。目前已被添加于多个类器官培养基中，可以防止细胞凋亡并促进类器官形成。
对于小鼠培养体系而言，成熟的肠道干细胞亚群多从Lgr5驱动子后表达eGFP的小鼠中分离提取；而对于人源培养体系而言，胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）及诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）均可用于肠道干细胞的分离培养（Spence et al., 2011)。根据所用的实验方法不同，培养物表现出的特性有轻微差异，干细胞来源的称为“类器官"(organoids)，而隐窝来源的称为“类肠道"(enteroids)( Wells and Spence, 2014 )。有研究者为鉴别不同的体外肠道培养物提出了新的命名法（Stelzner et al ., 2012 )，但目前多数文献均使用“类器官"统称这种新型的体外三维培养物。
相较于从隐窝中培养类器官，从单个干细胞培养类器官更复杂、更耗时、更昂贵，且需要特殊的实验器材。因此，单个干细胞进行类器官培养一般仅用于干细胞生物学研究，而相对简单地用隐窝进行类器官培养则广泛应用于其他类型研究。例如，野生型和转基因小鼠的肠隐窝可进行类器官培养，并作为一种新型的“细胞系"广泛应用于基础研究中。此外，从隐窝培养肠道类器官是研究营养和药物摄取（Sato and Clevers, 2013b）以及肠促胰岛素激素分泌的最佳模型（Zietek et al .,2015 )。使用标准实验室设备在几小时内即可实现以肠隐窝为基础的类器官培养，商业化即用型培养基也使得类器官培养更加容易。
厦门模基生物小鼠小肠类器官培养基套装是一款用于建立和维持小鼠肠道成体干细胞来源小肠类器官的wanquan培养基。生长在该wanquan培养基中的小鼠小肠类器官主要由干细胞、肠祖细胞和肠绒毛细胞、潘氏细胞、杯状细胞和少量肠内分泌细胞组成，在自我更新能力、组织结构、细胞类型和功能方面，小鼠小肠类器官重现了体内小肠上皮的特征。
如何分离隐窝并培养肠道类器官
厦门模基生物科技有限公司（Xiamen Mogengel）位于中国·厦门国家高新技术创业中心。公司致力于3D细胞培养核心原材料的研发与产业化升级。目前公司的产品有基质胶、类器官培养基、细胞因子、3D细胞培养耗材、3D细胞培养智能显微镜等。公司拥有4大技术研发中心：分子克隆和细胞编辑中心、实验动物中心、蛋白表达和纯化平台、类器官质检系统和自动化。
团队拥有十余年类器官技术研究基础，实力雄厚，科研意志坚定，学术态度严谨，大胆尝试，勇于创新。公司推出的基质胶、类器官培养试剂盒等产品广泛适用于类器官培养、血管生成实验、细胞侵袭（transwell）实验、PDX、CDX模型实验、肿瘤球培养、肿瘤移植、皮下成瘤实验、干细胞培养及细胞分化研究以及其他待开发实验类型。
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