如何分离隐窝并培养肠道类器官？

2009年Hans Clevers实验室对肠道培养体系进行了开创性地研究（Sato et al.,2009 )，2011年Sato等人发表了第一个描述完整分离肠隐窝以及后续培养的研究方案（Sato et al.,2011)。为了降低培养成本、简化培养流程，后续有多个文献报道了对此培养方法的改进（Mache et al.,2013;Vandussen et al.,2015;Zietek et al.,2015)，包括降低一些生长因子的浓度，或利用重组细胞系来生产Wnt3a、Noggin和R-Spondin1的条件培养基等。

目前常用的隐窝分离方法有两种。一种方法是利用EDTA从基底膜上分离隐窝，另一种方法则采用胶原酶消化肠道组织。本文将详细阐述两种方法提取小鼠及人源组织中隐窝的步骤及要点。

48孔细胞培养板、离心管（50mL)、细胞培养皿（6cm和10cm）、移液器（规格为10μL、200μL、1000μL和5000μL）、无菌吸头（规格为10μL、200μL 、1000μL和5000μL）、无菌镊子、无菌组织剪、70μm细胞过滤器、手术刀片。

MatrigengeL Matrix（推荐货号：082703/082755）；小鼠小肠类器官培养试剂盒（推荐货号：MA-0817H006）；类器官培养防黏附润洗液；类器官回收液（用于传代培养）；75%乙醇溶液；DPBS；双抗（青霉素、链霉素）；基础培养基；EDTA溶液（pH=8.0）。

· 配制5mMol/L EDTA溶液：10mL预冷DPBS溶液中加入

· 100μL0.5M EDTA溶液pH8.0，置于冰上备用。

小鼠小肠类器官原代建立准备物品

（1）按伦理规定处死小鼠后，表面喷洒酒精杀菌。在无菌条件下取出近胃端3～10cm肠组织，用镊子尽可能去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含双抗的DPBS溶液中。

小鼠小肠剪取

（2）使用手术剪将肠管剪开，荡洗2遍后，肠腔面朝上，一只手使用手术镊夹住肠组织一端，另一只手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于新的含DPBS的培养皿中清洗，重复清洗2次。将清洗后的小肠组织剪碎至2mm宽，转移至新的培养皿中，用DPBS清洗2遍。

小鼠小肠刮绒毛

（3）将清洗好的肠段转移至含5mMol/L EDTA的预冷DPBS中消化，置于4℃孵育20～30min。消化20分钟可用移液器轻柔吹打肠段，取上清显微镜下观察，待上清出现完整隐窝即可终止消化，若无隐窝可适当延长消化时间，尽量不超过30分钟。

（4）消化完成后，将组织碎片转移到新的含DPBS的培养皿中清洗，重复2次以去除EDTA。

（5）用5mL移液管在预冷的0.1%BSA的DPBS的培养皿或50mL离心管中吹打、重悬组织碎片，使组织反复穿过移液管尖以产生机械剪切力从而使隐窝与基底层分离，取一部分悬液镜检，当可以看到大量的隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液进行70μm滤网过滤。

滤网过滤后的组织悬液镜检图

（6）收集穿过滤网的组织悬液，300g离心力4℃离心3min。

（7）弃上清，使用1mL0.1%BSA的DPBS重悬组织沉淀，取20μl悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取包含所需隐窝量的悬液，300g离心力4℃离心3min，弃上清后置于冰上。

（1）用适量的Matrigengel Matrix重悬组织沉淀，推荐重悬密度为每10μL Matrigengel Matrix悬液包含70至100个隐窝，重悬后置于冰上，重悬时间不超30以避免Matrigengel Matrix过早凝固。（Matrigengel Matrix稀释比例应在70%以上以保证培养过程中Matrigengel Matrix的结构稳定性）。

（2）将Matrigengel Matrix和组织细胞的混合悬液点入48孔板底部正中央，每孔15μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。（为防止Matrigengel Matrix室温凝固，此步骤应尽快完成）。

基质胶与细胞混合液点板

（3）将接种完成后的培养板置于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育15min左右待Matrigengel Matrix凝固。

（4）待Matrigengel Matrix 完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的小鼠小肠类器官完全培养基，48孔板每孔250μL，避免破坏已凝固结构。

（5）将培养板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。

（6）每3天更换一次培养基，更换培养基时应避免破坏Matrigengel Matrix，密切监测类器官生长状态。

该实验流程适用于人肠壁全层组织，大约需10cm²大小，所需试剂体积及孵育时间需根据实际组织的大小作出相应调整。

剪刀、镊子(钝头)；培养皿；载玻片；50mL离心管；1.5mL EP管；70μm细胞筛；96孔板(平底)；离心机；摇床；1000/100μL枪头；显微镜；24孔板

不含Ca²+/Mg²+的HBSS；0.5M EDTA溶液；青霉素/链霉素(双抗，AA)；模基基质胶；模基生物人小肠类器官培养基套装

· MatrigengeL Matrix（4℃化冻）；

· 模基生物预冷盒；

· HBSS(4℃预冷过夜)；

· 1000/100μL枪头(4℃预冷过夜)；

· 离心机预冷(4℃)；冰盒；

· 制备人源隐窝培养基(hCCM)并置于室温或培养箱内预热；

· 制备基础培养基(BCM)(4℃预冷)；

· 将24孔板置于培养箱预热。

· 1个培养皿；

· 2个50mL离心管内加入30mL HBSS(加入1%双抗)，标记样本编号，置于4℃预冷；

· 5个50mL离心管内加入20mL HBSS置于4℃预冷，标记样本及组分编号；

· 2个50mL离心管(标记样本编号)；

· 1~2个70μm细胞筛；

相较于EDTA法，该方法成本稍低，无需选择特定的组分进行培养也可培养出大量体积较大的隐窝，但胶原酶酶法需要严格的实验流程，同时有被成纤维细胞污染的风险。

· 2个培养皿；

· 1~2个50mL离心管内加入20mL PBS(加入1%双抗),标记小鼠编号，置于4℃ 预冷；

· 1~2个50mL离心管，标记小鼠编号；

· 6个15mL离心管，标记小鼠编号；

· 称取适量的胶原酶XI于50mL离心管中，-20℃保存

·  1个70μm细胞筛；

（1）按照小鼠肠隐窝分离流程准备整个小肠样本。

（2）将小肠样本移至装有预冷PBS的培养皿中。将小肠切成肠段以便操作，用剪刀纵向剪开小肠，将小肠组织移至加入PBS的50mL离心管中，剧烈摇晃离心管5min以清洗组织。这个步骤重复多次直至清除小肠组织中的黏液及碎片

肠段清洗

（3）将组织移至装有预冷PBS的培养皿中，PBS仅需覆盖培养皿底部，用镊子及刀片将组织切成小块（约1mm²）。

（4）用5~10mL移液器将组织块和PBS移至15mL离心管中，加入预冷的PBS至10mL, 将离心管翻转5次，静置使组织块沉降。小心弃上清，再次加入10mL预冷的PBS，重复清洗步骤直至上清澄清(大约需4次)。

准备胶原酶XI溶液：将14mg胶原酶XI加入预热的40mL DMEM 6546，无菌过滤胶原酶溶液至50mL离心管中，置于37℃水浴锅中。

（5）弃去上清，尽可能不残留PBS，加入10mL预热的胶原酶XI溶液，混匀。

（6）在37℃水浴中孵育4.5min，小心翻转离心管30s，静置45s使组织块沉降，弃上清。

（7）加入10mL预热的胶原酶XI溶液，混匀；在37℃水浴中孵育4.5min，摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，弃上清。

（8）加入10mL预热的胶原酶XI溶液，混匀；在37℃水浴中孵育15min，分别在4.5min、9.5min、14.5min后摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，弃上清。

（9）加入10mL预热的胶原酶XI溶液，混匀；在37℃水浴中孵育15min，分别在4.5min、9.5min、14.5min后摇晃离心管30s，静置45秒使组织块沉降。

（10）取出上清移至新的15mL离心管中，100g、4℃离心2min，弃上清，10mL预冷PBS重悬沉淀。

（11）100g、4℃离心2min，弃上清，10mL预冷PBS重悬沉淀，将重悬液通过70μm细胞筛至适当标记的50mL离心管中。

（12）取10μL重悬液于显微镜下进行隐窝计数，估算隐窝总个数(10mL 中隐窝总个数=10μL中隐窝个数×1000)。按每孔种100~200个隐窝计算所需重悬液体积，移至适当标记的50mL离心管中。

（13）按照小鼠肠隐窝提取流程中的第12~14步骤进行后续实验。

（1）按照小鼠肠隐窝分离流程准备结肠样本。

（2）按照小肠隐窝分离流程中第2~4步骤进行实验。

准备胶原酶XI溶液：将14mg胶原酶XI加入预热的40mL DMEM  6546，无菌过滤胶原酶溶液至50mL离心管中，置于在37℃水浴锅中。

（3）弃上清，尽可能不残留PBS，加入10mL预热的胶原酶XI溶液，混匀。

（4）在37℃水浴中孵育9.5min，剧烈摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，弃上清。

（5）加入10mL预热的胶原酶XI溶液，混匀；在37℃水浴中孵育14.5min，剧烈摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，弃上清。

（6）加入10mL预热的胶原酶XI溶液，混匀；在37℃水浴中孵育15min，分别在4.5min、9.5min、14.5min后摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，该上清即为组分1，将其移至适当标记的15mL离心管中。

（7）加入10mL预热的胶原酶XI溶液，混匀；在37℃水浴中孵育15min，分别在4.5min、9.5min、14.5min后摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，该上清即为组分2。

同时，将组分1于100g、4℃离心2min，弃上清；10mL预冷PBS重悬沉淀，再次于100g、4℃离心2min，弃上清；5mL预冷PBS重悬沉淀，置于冰上。

（8）将组分2的上清移至15mL离心管中，于100g、4℃离心2min，弃上清；10mL预冷PBS 重悬沉淀，再次于100g、4℃离心2min，弃上清；5mL预冷PBS重悬沉淀。

（9）将组分1重悬液与组分2重悬液混合得到10mL隐窝悬液，通过70μm细胞筛至适当标记的50mL离心管中。

（10）取10μL重悬液于显微镜下进行隐窝计数，估算隐窝总个数(10mL中隐窝总个数=10μL中隐窝个数×1000)。按每孔种100~200个隐窝计算所需重悬液体积，移至适当标记的50mL离心管中。

（11）按照小鼠肠隐窝提取流程中的第12~14步骤进行后续实验。

使用胶原酶分离人源肠隐窝的实验流程与小鼠肠隐窝的流程非常类似，器械、试剂、溶液及准备工作与小鼠肠隐窝的分离相同。下述的实验方案适用于约5.5cm²大小的肠组织样本。

（1）用预冷的PBS清洗肠组织。

（2）将组织移至装有预冷PBS的培养皿中，用剪刀和镊子小心去除肌层及黏附的结缔组织。

（3）弃PBS，取新的预冷PBS清洗组织，再重复2次。

（4）按照小肠隐窝分离流程中第3~5步骤进行实验，胶原酶溶液中胶原酶XI的使用剂量如下：

· 小肠组织：15mg/40mL DMEM 6546

· 大肠组织：20mg/40mL DMEM 6546

（5）在37℃水浴中孵育9.5min，剧烈摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，该上清即为组分1，将其移至适当标记的15mL离心管中。

（6）用10mL预热的胶原酶XI溶液重悬组分1的沉淀，混匀后在37℃水浴中孵育9.5min,剧烈摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，该上清即为组分2，将其移至适当标记的15mL离心管中。

同时，将组分1于100g、4℃离心2min，弃上清；10mL预冷PBS重悬沉淀，再次于100g、4℃离心2min，弃上清；5mL预冷PBS重悬沉淀，置于冰上。

（7）用10mL预热的胶原酶XI溶液重悬组分2的沉淀，混匀后在37℃水浴中孵育9.5min，剧烈摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，该上清即为组分3，将其移至适当标记的15mL离心管中。

同时，将组分2于100g、4℃离心2min，弃上清；10mL预冷PBS重悬沉淀，再次于100g、4℃离心2min，弃上清；5mL预冷PBS重悬沉淀，置于冰上。

（8）用10mL预热的胶原酶XI溶液重悬组分3的沉淀，混匀后在37℃水浴中孵育9.5min，剧烈摇晃离心管30s，静置45s使组织块沉降，该上清即为组分4，将其移至适当标记的15mL离心管中。

同时，将组分3于100g、4℃离心2min，弃上清；10mL预冷PBS重悬沉淀，再次于100g、4℃离心2min，弃上清；5mL预冷PBS重悬沉淀，置于冰上。

（9）将组分4的上清于100g、4℃离心2min，弃上清；10mL预冷PBS重悬沉淀，再次于100g、4℃离心2min，弃上清；5mL预冷PBS重悬沉淀。

（10）将组分1~4的重悬液混合后，通过70μm细胞筛至适当标记的50mL离心管中，并于350g、4℃离心3min。

（11）按照人源肠隐窝提取流程中的第13~16步骤进行后续实验。

小鼠和人源类器官培养的主要区别在于其培养基组分的不同。小鼠小肠类器官培养所需要的补充因子最少，人源类器官培养需要多个生长因子和抑制剂以维持生长，这对于前几天的培养尤为重要。在培养基中加入Wnt3a可抑制分化，增加干细胞/扩增细胞的比例，促进类器官囊泡样生长。减少Wnt3a用量、撤掉SB202190或加入可抑制Notch通路的γ-分泌酶抑制剂可诱导类器官向不同的肠上皮细胞谱系分化。

添加与不添加Wnt3a的培养基培养下小鼠小肠类器官生长情况对比图

48孔细胞培养板、离心管（50mL)、细胞培养皿（6cm和10cm）、移液器（规格为10μL、200μL、1000μL和5000μL）、无菌吸头（规格为10μL、200μL 、1000μL和5000μL）。

模基生物基质胶；类器官培养防黏附润洗液；类器官回收液（用于传代培养）。

（1）将培养板置于冰上，吸出类器官培养基，不要破坏含有类器官的类器官培养基质胶。

（2）在每个孔中加入10倍体积冷的（2~8°C) 类器官回收液。如，取5μl基质胶，加入50μl回收液。

（3）在2~8°C或冰上孵育50分钟，用手轻轻摇动。（孵育10~15分钟后，您可以用细胞刮板或移液管轻轻取出基质胶圆顶，以加速恢复过程。一旦孔底的基质胶圆顶状形状消失，类器官开始漂浮在溶液中，孵育即完成。）

（4）轻轻地将孔内的内容物转移到适当的离心管中，单层类器官应格外小心处理，因为细胞很容易脱落。

（5）以25~50xg的离心力，在2~8°C下离心，离心管3分钟，将类器官离散成颗粒，并丢弃上清液。

（6）用10倍类器官基础培养基在室温下清洗一次类器官，重复上面的第5步。

（7）根据密度加入对应批次的细胞外基质重悬类器官碎片，冰上混匀，取15μL混合悬液点入48孔板中央。

（8）将接种完成后的培养板37℃凝固15min左右，沿壁缓慢加入250μL/孔类器官完全培养基。

（9）将细胞培养板放入培养箱中进行培养，每天于倒置显微镜下观察类器官的生长状态，每2～3天更换完全培养基。（此时显微镜下可观察到，细胞碎片均已清除。）

模基生物活组织细胞保存液

（5）在分离过程中使用的离心管和移液管使用前用类器官培养防粘附润洗液润洗，以便提升隐窝回收率。

模基生物类器官培养润洗液

（6）类器官回收液需提前预冷至2-8°C。

模基生物类器官回收液

常用的实验方法如定量PCR、蛋白印迹、流式细胞术或免疫荧光(IF)/免疫组织化学 (IHC) 染色等均可用于分析肠道类器官。类器官既可作为细胞团新鲜固定，也可以包埋在OCT或石蜡中从而广泛应用于抗体检测。一般来说，肠道类器官培养的验证主要指在mRNA或蛋白质水平上检测不同亚型肠上皮细胞（干细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠吸收 细胞、肠内分泌细胞、tuft细胞）标志物的表达。